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ISSN 0582-9879                                          ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(9): 864–872                                    CN 31-1300/Q

 

Purification and Partial Characterization of Luffin P1, A Peptide with Translational Inhibitory Activity and Trypsin Inhibitory Activity, from Seeds of Luffa cylindrica

LI Feng, XIA Hen-Chuan, YANG Xin-Xiu, HU Wei-Guo, LI Zhen, ZHANG Zu-Chuan

(Key Laboratory of Proteomics， Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China )

 

Abstract        A peptide, luffin P1, from seeds of Luffa cylindrica, was purified by ammonia sulfate precipitation, CM-52 ion exchange chromatography, Blue-gel affinity chromatography and FPLC Mono S ion exchange chromatography. Its molecular weight was 5226.5 as determined by MALDI-TOF-MS analysis. The sequence of N-terminal 11 amino acids of luffin P1 was identical with the partial N-terminal sequence (from G3 to R13) of 6.5K Arg/Glu rich peptide, which was also isolated from the seeds of Luffa cylindrica. Besides, luffin P1 had a very high homology with a trypsin inhibitor, named C2 peptide, from pumpkin seeds. Interestingly, the purified luffin P1 not only showed a strong inhibitory activity on protein synthesis in rabbit reticulocyte lysate cell-free translation system with IC50 of 0.6 nmol/L, but also had trypsin inhibitory activity with IC50 of 22 μmol/L.

 

Key words     seeds of Luffa cylindrical; luffin P1; translational inhibitory activity; trypsin inhibitory activity

 

丝瓜籽中一种具有翻译抑制活性和胰蛋白酶抑制剂活性的多肽——Luffin P1的纯化和性质

李丰    夏恒传     杨欣秀     胡维国     李臻    张祖传*

( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组学重点实验室， 上海 200031 )

 

摘要       通过硫酸铵分级沉淀、 CM-52阳离子交换层析、 蓝胶亲和层析和FPLC Mono S阳离子交换层析， 从丝瓜籽抽提液中分离到一种多肽luffin P1。 经MALDI-TOF MS测得其分子量为5226.5。 氨基酸序列测定及同源性分析发现， luffin P1的N端11个氨基酸序列与丝瓜籽中的一种6.5K富含Arg/Glu的多肽AGRP的部分序列相同， 并与南瓜籽中一种胰蛋白酶抑制剂C2肽具有很高的同源性。 体外分析表明， luffin P1同时具有两种生物活性： (1) 对兔网织红细胞裂解液系统蛋白质生物合成有较强的抑制作用， IC50为0.6 nmol/L； (2) 具有明显的胰蛋白酶抑制活性， IC50为22 μmol/L。

 

关键词   丝瓜籽； Luffin P1； 翻译抑制活性； 胰蛋白酶抑制活性

 

高等植物中广泛存在一种名为核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）的毒蛋白。 它具有损伤真核细胞核糖体， 从而抑制蛋白质合成的功能。 根据肽链的组成和性质， 植物来源的核糖体失活蛋白通常被分为三类： Ⅰ型为单链型， 分子量通常为25～32 kD， 具有N-糖苷酶活性， 能水解真核细胞核糖体的28S rRNA上4324位腺苷上的N-C糖苷键， 使核糖体失活； Ⅱ型为双链型， 由一条类似Ⅰ型核糖体失活蛋白的肽链和一条具有凝集素活性的肽链通过二硫键连接形成， 分子量约为60 kD。 Ⅲ型核糖体失活蛋白也为双链， 但两条肽链之间通过非共价相互作用结合在一起， 且两条链都参与形成N-糖苷酶活性中心， 其分子量约为25 kD。 近年来的研究发现， 核糖体失活蛋白除了具有N-糖苷酶活性外， 还具有多种生物活性， 如：抗病毒、 抗真菌、 抗肿瘤活性［1～3］、 诱导细胞凋亡［4］、 抑制HIV整合酶活性［5, 6］等。

最近几年的研究发现多种葫芦科植物种子中还普遍存在一类分子量仅为8～12 kD的小分子核糖体失活蛋白， 如γ-momorcharin［7］、 luffin S［8］、 S-trichokirin［9］、 moschins［10］、 benincasin［11］等。 它们有些性质与I型核糖体失活蛋白相似， 有的还具有抗真菌活性。 我们在对丝瓜籽中的低分子量核糖体失活蛋白的研究中， 分离到一种分子量仅为6 kD左右的多肽， 并将它命名为luffin P1。 该肽的N端序列与丝瓜籽中6.5K AGRP的部分序列相同， 并且与一种南瓜籽胰蛋白酶抑制剂C2肽有很高同源性。 本文对该肽的某些性质及两种生物活性进行了较为深入的研究。

 

1    材料和方法(Materials and Methods)
1.1   材料

丝瓜（Luffa cylindrica）籽购自上海市种子公司。 Wistar大鼠由中科院实验动物中心提供。 CM-52纤维素为Whatman公司产品。 亲和凝胶蓝胶购自Bio-Rad公司。 兔网织红细胞裂解液按应文斌等［12］方法制备， 其他试剂均为分析纯。
1.2 方法

1.2.1      Luffin P1的分离纯化       丝瓜籽抽提液按文献［13］所述方法进行。 将抽提液用硫酸铵分级沉淀， 取50％～90％饱和度的沉淀， 对10 mmol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液（PB）充分透析后上CM-52柱（1.2 cm×20 cm）， 先用同样的缓冲液洗至流出液A280值小于0.01后， 再用400 ml含0～0.3 mol/L NaCl的PB、 pH 7.5进行线性梯度洗脱。 合并有抑制蛋白质生物合成活性的低分子量蛋白质和多肽的流出峰， 冷冻干燥后对10 mmol/L Tris·HCl， pH 7.5缓冲液充分透析后上蓝胶亲和柱（1 cm×8 cm）， 先用同样的缓冲液洗去杂蛋白质， 然后用含1 mol/L NaCl的10 mmol/L Tris·HCl， pH 7.5缓冲液洗脱亲和吸附的蛋白质和多肽。 冻干洗脱的样品， 对20 mmol/L PB， pH 6.8充分透析后， 上FPLC Mono S HR 5/5离子交换柱。 然后以0～0.8 mol/L NaCl的20 mmol/L PB， pH 6.8进行梯度洗脱， 流速0.5 ml/min。 收集活性峰， 冻干、 经Sephadex G-25脱盐后即为纯化的luffin P1样品， 保存于－20 ℃。
1.2.2      luffin P1的分子量测定     15％ Tris·Tricine SDS PAGE分析按文献［14］方法进行。 分子量在Bruker公司ProFlex Ⅲ MALDI-TOF 质谱仪上进行测定。

1.2.3      Luffin P1 N端氨基酸序列分析        Luffin P1 N端氨基酸序列采用Perkin-Elmer公司475A 蛋白质序列分析仪进行测定。
1.2.4      Luffin P1对无细胞系统蛋白质生物合成的抑制活性的测定    按应文斌等［12］方法进行分析。
1.2.5      核糖体失活机制分析        大鼠肝核糖体按Spedding［15］方法制备， 核糖体失活机制分析根据Endo等［16］方法进行。
1.2.6      胰蛋白酶抑制活性测定    胰蛋白酶抑制活性按文献［17］所述方法进行。

2   结果（Results）

2.1 Luffin P1的分离纯化

丝瓜籽抽提液经55％～90％饱和度硫酸铵沉淀的样品， 上CM-52阳离子交换柱后， 用0.1～0.3 mol/L NaCl线性梯度可从柱上洗出多个蛋白质峰［图1 (A)］， 其中F1和F2分别含有Ⅰ型核糖体失活蛋白luffin A和luffin B， F4峰以多肽成分为主， 并具有抑制蛋白质生物合成的活性。

 

Fig.1      Purification of luffin P1 from seeds of Luffa cylindrical

(A) CM-52 ion exchange chromatography of crude luffin P1 preparation from ammonia sulfate precipitation. The column was eluted with a linear 0－0.3 mol/L NaCl gradient in 10 mmol/L sodium phosphate buffer pH 7.5. Fraction size: 2.0 ml. (B) Blue-gel affinity chromatography of fraction F4 from CM-52 chromatography. The column was washed initially with the starting buffer (10 mmol/L Tris·HCl, pH 7.5) and then eluted with 1mol/L NaCl in the starting buffer. (C) Mono S FPLC of fraction obtained from blue gel affinity chromatography. The column was eluted with a 0－0.8 mol/L NaCl gradient in 20 mmol/L sodium phosphate buffer, pH 6.8. The black bar represents fractions contain luffin P1.

 

蓝色染料Cibacron blue F3GA是一种结构类似于NAD＋的磺化多芳香环化合物， 能与含核苷酸结合部位的蛋白质特异结合， 可作为配基与琼脂糖基质制成亲和凝胶蓝胶。 植物核糖体失活蛋白均以真核生物rRNA为底物， 有核苷酸结合部位， 因而可用该亲和凝胶进行纯化。 用蓝胶柱对F4样品进行亲和层析也取得了很好的效果［图1 (B)］。 由亲和柱纯化的样品再经FPLC Mono S柱进一步纯化， 得到两个峰［图1 (C)］， 其中P1经15％Tris·Tricine PAGE鉴定为单一条带， 其分子量约为6 kD（图2， 泳道5）， 我们将这一多肽命名为luffin P1。 图2为不同纯化步骤样品的15％ Tris·Tricine PAGE分析结果。

Fig.2      15% Tris·Tricine SDS-PAGE pattern of luffin P1 preparations from different purification steps

1, protein standard molecular weight markers; 2, 55%－90% saturated ammonia sulfate precipitation of crude extract from Luffa cylindrica seeds; 3, fraction F4 of CM-52 ion exchange chromatography; 4, sample after blue gel affinity chromatography; 5, luffin P1 purified by Mono S FPLC.

 

2.2 Luffin P1的分子量测定及其N-端氨基酸序列分析

纯化的luffin P1在Tris·Tricine PAGE分析中呈单一的条带（图2， 泳道5）， 根据其迁移率及分子量标准蛋白质的迁移率计算得到的分子量约为6 kD。 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进一步测定luffin P1的准确分子量为5226.5±1 (见图3)。

 

Fig.3      MALDI-TOF mass spectra of purified luffin P1 (［M+H］+=5227.5)

 

序列分析的结果表明luffin P1的N端11个氨基酸序列为：GSPRTEYEACR。 与已知的丝瓜籽中的蛋白质和多肽的序列进行比较， 发现它的N端序列与Kimura等［18］报道的6.5 K AGRP的N端3～13位氨基酸的序列完全一致。

 

Fig.4      Inhibitory activities of Luffin P1 and trichosanthin in a cell-free protein synthesis system from reticulocyte lysate

Data are represented as x(mean)±s， n=3; Luffin P1, IC50=6.03×10-10 mol/L; trichosanthin, IC50=8.9×10-11 mol/L.

 

2.3 Luffin P1对无细胞系统蛋白质生物合成的抑制活性

Luffin P1对兔网织红细胞裂解液的蛋白质合成抑制的测定结果见图4， 其中Luffin P1和天花粉蛋白（Trichosanthin， TCS）的浓度由Bradford方法测定， 以牛血清白蛋白作为标准。 其中Luffin P1和TCS的IC50分别为6.03×10-10 mol/L和8.9×10-11 mol/L。 TCS是活性很强的单链核糖体失活蛋白， 而Luffin P1的分子量仅为TCS的五分之一， 可见它对体外蛋白质生物合成的抑制活力是相当强的。

2.4 Luffin P1失活核糖体机制的分析

大鼠肝核糖体与不同催化量的Luffin P1或TCS保温后， 核糖体RNA经抽提、 苯胺处理， 再经3.5％ PAGE电泳分析后用0.04％亚甲基蓝染色的结果见图5。 与TCS相同， 核糖体RNA经Luffin P1和苯胺处理后产生一条约450 nt的特异性核酸条带（图5箭头所指条带）。 天花粉蛋白是一种典型的rRNA N-糖苷酶型核糖体失活蛋白， 它能专一性地水解核糖体28 S rRNA上4324位的腺嘌呤， 苯胺处理使RNA在脱嘌呤的位点水解， 产生450 nt的特征性核酸片段。 由上述结果可以推测， Luffin P1失活核糖体的机制与天花粉蛋白相似， 也是N-糖苷酶催化型的。

Fig.5      rRNA N-glycosidase activity assay of luffin P1 and trichosanthin

Rat liver ribosomes were treated by Luffin P1 or trichosanthin and then aniline, the resulted rRNA fragments were analyzed by 3.5% PAGE. The arrow indicates the position of α-fragment released from the rRNA. 1, control (only treated with aniline); 2, treatment with 5 ng trichosanthin and aniline; 3, treatment with 5 ng trichosanthin only; 4, 6, treatment with 5 ng and 10 ng luffin P1 respectively and then with aniline; 5, 7, treatment with 5 ng and 10 ng luffin P1 only.

 

2.5 Luffin P1的胰蛋白酶抑制活性

通过数据库检索， 发现luffin P1的N端11个氨基酸序列与一种从南瓜籽中分离到的胰蛋白酶抑制剂C2肽的N端序列具有很高的同源性［17］。胰蛋白酶抑制活力的测定， 验证了luffin P1对胰蛋白酶也有一定的抑制作用， 其IC50为22 μmol/L (见图6)。

Fig.6      Trypsin inhibitory activity of luffin P1

Each point is the mean of three assays. luffin P1, IC50=2.2 μmol/L.

 

3   讨论（Discussion）

早在1988年， Masahiro等［19］就从丝瓜籽中分离到了两种单链核糖体失活蛋白luffin-a和luffin-b， 它们的分子量为27～28 kD， 是迄今已发现的活性最强的单链核糖体失活蛋白。 1994年， Gao等［8］发现了分子量为8 kD左右的小分子核糖体失活蛋白luffin S。 随后， 对丝瓜籽小分子核糖体失活蛋白的一些性质又有进一步研究［13］。 本文在对小分子核糖体失活蛋白的研究中又发现一种对蛋白质生物合成有抑制活性的分子量仅为5226.5的多肽， 并将之命名为luffin P1。

Luffin P1具有较强的翻译抑制活性， 催化量（5 ng）的luffin P1作用大鼠肝核糖体， 仍能显示明显的N-糖苷酶活性。 纯化的luffin P1的N端氨基酸序列测定和质谱分析的结果都充分说明样品具有很高的纯度。 数据库检索结果表明luffin P1与已知的核糖体失活蛋白同源性很低， 因而不可能是已知核糖体失活蛋白的加工产物。 然而， luffin P1的N端11个氨基酸残基的序列与丝瓜籽中6.5K AGRP的N端部分序列（G3-R13）完全相同。 6.5K AGRP是一种富含Arg/Glu残基的多肽， 它由47个氨基酸残基组成， 有两对链内二硫键［18］。 根据文献报道的6.5K AGRP的序列， 计算出其3～45位氨基酸残基的肽链的准确分子量为5226.6， 这与luffin P1的分子量一致。 它们都来源于丝瓜籽且部分序列相同， 因此可以推断， luffin P1比6.5K AGRP少4个氨基酸， 即在N端和C端各少了两个氨基酸残基。 luffin P1的cDNA克隆（GenBank accession number: AF537345， 另文发表）的结果已证实了这种推断。 Kimura等人为了研究丝瓜籽中多肽的结构， 通过凝胶过滤层析、 疏水层析和RP-HPLC从丝瓜籽中分离到了6.5K AGRP。 而本文为了研究具有核糖体失活活力的多肽的性质， 主要采用了通常纯化核糖体失活蛋白的方法， 通过离子交换层析、 蓝胶柱亲和层析和Mono S FPLC分离得到了luffin P1。 它比6.5K AGRP少四个氨基酸残基， 这种差异可能是因为不同地域或不同成熟期的种子而引起的， 也有可能是由于蛋白质的翻译后加工所产生的。 6.5K AGRP的真正功能尚无报道， Kimura等推测它是一种贮存蛋白， 能作为氮源和碳源在种子的萌发和幼苗生长时提供所需的养分［18］。 本文确定了luffin P1同时具有失活核糖体和胰蛋白酶抑制剂两种活性， 从而推测这类多肽可能还具有保护种子免受外来生物侵害的功能。

氨基酸序列比较已经被广泛用于预测蛋白质的功能。 在数据库检索中发现luffin P1的N端氨基酸序列和南瓜籽中一种名为C2肽的胰蛋白酶抑制剂的N-端序列具有很高的同源性。 胰蛋白酶抑制实验验证了luffin P1也具有明显的抑制活性。 luffin P1的分子量仅为5.2 kD， 但同时具有两种不同的生物活性， 这是一个很有趣的现象。

另外， 如此小的多肽怎样折叠形成N-糖苷酶所具有的空间构像， 它的不同活性的结构基础又是什么等问题都是非常值得深入研究的。 luffin P1 N端序列的测定为它的基因克隆、 分子改造和结构与功能的研究打下了很好的基础。

近年来， 以核糖体失活蛋白作为 “弹头”的免疫毒素在医学研究中被广泛应用， 并且在某些疾病的治疗中取得了较好的效果。 而具有蛋白质生物合成抑制活性的多肽， 具有分子小的优点， 免疫原性相对较低， 用它们研制的免疫毒素不仅有利于进入肿瘤细胞， 同时还可以降低由“弹头”引起的毒副作用。 因而它们会有较好的应用前景。

 

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Received: May 22, 2003       Accepted: June 23, 2003

This work was supported by a grant from Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KSCX2-3-06)

*Corresponding author: Tel, 86-21-54921281; Fax, 86-21-54921011; e-mail, [email protected]